Hvordan kan jeg stille opp DNA for Analysis

? Agarosegelelektroforese er den vanligste metoden for visuell DNA fragment analyse, noe som gjør at teknikere til å visuelt skille DNA- fragmenter basert på størrelse . Den agarosegel opprettholder et magnetisk felt , og siden DNA har en negativ ladning , beveger den mot den positive ende av det magnetiske felt . Mindre DNA-fragmenter gå raskere gjennom gelen og større fragmenter bevege seg saktere . DNA- fragmenter blir fluorescensmerket farget med en interkalerende middel som er kjent som etidiumbromid . Dette gjør det mulig for sammenligning av flere elektroforese DNA-prøver på en gel . Du trenger
agarosegel , 0,7 prosent til 2 prosent
Tris - borat - EDTA ( TBA ) , tris - acetat - EDTA ( TAE ) , sodium lithium acetate ( LA ) , borsyre ( SB ) buffer
Etidiumbromid
Gel loading dye
Gel skuffen
elektroforese kammer
Hansker
beskyttende slitasje øye arkiv Pipette
Elektroforese kam
Vis flere Instruksjoner
Forbereder en 0,7 prosent agarosegel
en

Vei opp 0,7 g agarose pulver og deretter plassere inn en stor ( 250 ml ) erlenmeyerkolbe .
to

Legg 100ml av en 1X ( vanlig styrke ) buffer ( TAE , TBE , SB eller LB buffer ) til erlenmeyerkolbe inneholder agarose pulver .
3

Mikrobølgeovn eller varme ved hjelp av en gassbrenner i ca ett minutt til løsningen blir klar og agarose er oppløst.
4

Fjern kolben fra varmekilden og la den avkjøles til 55 til 60 grader Celsius.
5

til 1 pl ( mikroliter ) av etidiumbromid til den avkjølte agarose -løsning ved hjelp av en passende størrelse pipette , vanligvis 1 ml . Roter løsningen for å blande.
6

Hell gelen langsomt inn i gelen brettet , slik det er ingen bobledannelse i løpet av denne prosessen. Hvis det ikke er noen som følger godt dammer med gel skuffen , bruk maskeringstape for å danne dem .
7

Plasser en elektroforese kam forsiktig inn i gel , noe som sikrer en fast stilling og i riktig retning . Elektroforese kammer kan variere sterkt på antall tenner de har. La gelen satt i ca 25 minutter
8

Senk gel i samme buffer brukes til å forberede agaorse løsning - . I dette tilfellet , en 1X buffer . Senk gel i opp til 5 ml buffer .
Utarbeidelse og Lasting av DNA inn i agarosegel for analyse
9

Transfer 5 til 10 mL av prøven (e) fra deres reaksjonsrørene til friske rør. I tilfelle du ønsker å bruke hele reaksjonsblandingen , er et nytt rør ikke nødvendig .
10

Legg 0.2X lasting buffer til hver av dine friske prøverør som inneholder din DNA-prøve for lasting .

11

Fjern elektroforese kammen sakte , slik at du ikke bryter gel eller lage noe plass mellom bunnen av gel og gel skuffen .
12

Legg fem 12 ul av en passende DNA-markør til den første brønnen som skapes av elektroforese kam. Hvorvidt en DNA- markør er hensiktsmessig avhenger av størrelsen på fragmentene du forventer fra prøven din .
13

Load fem til 10 mL av prøvene i de resterende brønnene og tilsett samme mengden av den samme DNA-markør inn i den siste brønnen .
14

Plasser elektrodene inn i elektroforese kammeret ved å sette ledningene inn i de riktige sokler inn i kammeret og angir den elektrode som 50 til 150 V.

15

La gelen til å kjøre for én til fire timer .
resultatanalyse
16

Fjern gel fra gelen kammeret og plassere det enten i en UV rom for visuell identifisering , eller sted inn i en maskin som er i stand til å ta et bilde av gelen .
17

Mål markører avstand av migrasjon i sine brønner .

18

Plott avstander mot størrelsen på band på semilog millimeterpapir og tegne en best mulig passform linje.
19

Beregn avstander på dine ukjente band .

20

anslå størrelsen på dine ukjente band ved å tegne en linje opp fra distanse etter dine ukjente band som oppfyller linjen av beste passform .
21

Tegn en linje fra dette knutepunktet over til størrelsen aksen .