Hvordan oppdage NADH

nikotinamid adenin dinuceltoide ( NADH ) , forkortet " NAD " , er et koenzym som finnes i levende celler som produserer kjemiske reaksjoner i proteiner . Farmasøytiske selskaper studere NADH grunn av sin metabolisme prosess , og syntetisk lage det for en rekke formål . Siden NADH er mikroskopisk , kan det blotte øye ikke øye på den . Du må vitenskapelige tester , og et analysesettfor å detektere dens nærvær. Du trenger
Tørris
Micro - sentrifuger arkiv Eppendorfrør på
Vis flere Instruksjoner
Reagens Tilberedning
en

Sett sykkel buffer på et telleverk , og at bufferen for å oppnå romtemperatur . Den ideelle temperaturen for bufferen er 22 grader Celsius .
To

Rekonstituer NAD sykling enzym blanding med nøyaktig 220 mikroliter sykling buffer . Frys løsningen i temperaturer under -70 grader Celsius .
3

Rekonstituer NADH utvikler med 1,2 ml ddH2O . Bland forsiktig løsningen til det er helt oppløst . Ikke vortex .
4

Rekonstituer NADH standard med 200 mikroliter ren dimethylsulfoxyd .
Prøvepreparering
5

Vask cellene med fosfat -bufret saltvann .
6

Pellet 2x10 ( 5 ) celler for hver enkelt analyse inn i en mikro - sentrifugerør og kjører på 2000 RPM i 5 minutter .
7

Ekstraher cellene med 400 mikroliter av NAD /NADH ekstraksjon buffer ved frysing og tining av cellene i to sykluser - 20 minutter på tørr is og 10 minutter ved romtemperatur. Vortex utdraget celler i nøyaktig 10 sekunder .
8

Spinn celleprøver i en mikro - sentrifuger ved 14000 RPM i nøyaktig fem minutter .
9

Overfør NAD /NADH celler i et rent rør .
10

Dilute 10 mikroliter av NADH standard med 990 mikroliter NAD /NADH utvinning buffer
Assay Protocol . Til 0, 2, 4, 6, 8, 10 mikroliter av den fortynnede løsning til en 96-brønns plate i duplikat for å skape 0 , 20, 40, 60 80, 100 godt standard. Fyll den siste brønnen med 50 mikroliter av NAD /NADH utvinning buffer .
11

Transfer 50 mikroliter av den ekstraherte celleprøver i en 96-brønns plate i duplikater som før.
12

Forbered celleprøverfor NADH deteksjon . Separer NAD fra celleprøverved å sette 200 mikroliter av den ekstraherte celleprøver i Eppendorf-rør . Varm rørene til 60 grader celsius i nøyaktig 30 minutter inn i en temperaturkontrollertvannbad. Raskt avkjøle prøvene ved å plassere rørene på is. Spin prøvene i mikrosentrifugefor å fjerne bunnfall. Overføring 50 mikroliter av den dekomponerte prøvene inn i en 96-brønns plate i duplikater som før.
13

Bland NAD sykling buffer blanding med 100 mikroliter av NAD sykling buffermiksog 2 mikroliter av NAD sykling enzym. Til 100 mikroliter av denne løsningen i hver brønn av NADH -standarder og prøver.
14

Inkuber platen ved romtemperatur i nøyaktig 5 minutter . Denne prosessen vil konvertere NAD til NADH .
15

Legg 10 mikroliter av NADH utbygger i hvert godt . La maskinen stå i romtemperatur i minst en time og maksimalt 4 timer .
16

Les plate og beregne NADH .