I en ELISA-test følges en rekke trinn, som inkluderer:
1. Belegg av mikroplatebrønnene med innfangningsantistoffet spesifikt for målanalytten.
2. Tilsetning av prøven eller standarden som inneholder analytten.
3. Inkubasjons- og vasketrinn for å tillate binding av analytten til fangeantistoffet.
4. Tilsetning av et deteksjonsantistoff konjugert med et enzym (f.eks. pepperrotperoksidase eller alkalisk fosfatase).
5. Inkubasjons- og vasketrinn for å tillate binding av deteksjonsantistoffet til den fangede analytten.
6. Tilsetning av et substrat spesifikt for enzymet som brukes i deteksjonsantistoffkonjugatet.
7. Inkubasjons- og stopptrinn for å tillate den enzymatiske reaksjonen og fargeutviklingen.
Det siste trinnet resulterer i en fargeendring, som kan måles spektrofotometrisk ved en bestemt bølgelengde. Fargeendringen er vanligvis fra fargeløs til en synlig farge, for eksempel gul, blå eller rød. Intensiteten til fargen er proporsjonal med mengden analytt som er tilstede i prøven.
Derfor, i en ELISA-test, er fargeendringen fra fargeløs til farget, ikke fra mørk (svart eller grå) til klar.