Hvorfor trengte du å vaske brønnene etter hvert trinn?

Vasking av mikroplatebrønnene etter hvert trinn i ulike biokjemiske og molekylærbiologiske analyser som ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), DNA/RNA-isolering, PCR og Western Blotting er en viktig del av den eksperimentelle protokollen. Hensikten med vasketrinn er å fjerne gjenværende reagenser, reaksjonskomponenter eller eventuelle forurensninger som kan forstyrre påfølgende trinn eller påvirke nøyaktigheten og spesifisiteten til analysen.

Her er noen grunner til at vasketrinn er nødvendig:

Fjerning av ubundne stoffer: Vasketrinn etter tilsetning av reagenser eller antistoffer hjelper til med å fjerne eventuelle ubundne stoffer, for eksempel overflødig antistoffer, uspesifikke bindingsmolekyler eller reaksjonskomponenter som ikke fanges opp eller er bundet til den faste fasen. Dette sikrer at deteksjonssignalet er spesifikt og fritt for bakgrunnsinterferens.

Minimering av krysskontaminering: Vasketrinn reduserer effektivt risikoen for krysskontaminering mellom prøvene. Dette er spesielt viktig når flere prøver behandles samtidig, da det forhindrer overføring av reaksjonskomponenter eller forurensninger fra en brønn til en annen. Vasking bidrar til å opprettholde integriteten og nøyaktigheten til individuelle prøveresultater.

Effektiv fjerning av forstyrrende stoffer: Vasking er nødvendig for å fjerne stoffer som kan forstyrre påfølgende trinn. For eksempel, i en ELISA-analyse, hjelper vask med å eliminere ubundne konjugat-antistoffkomplekser, og reduserer derved bakgrunnsfargeutviklingen og øker spesifisiteten til den kolorimetriske reaksjonen. Ved PCR fjerner vask nukleotider, primere og polymeraser fra tidligere amplifikasjonssykluser, noe som minimerer risikoen for kontaminering med overføring og sikrer nøyaktig amplifikasjon i neste syklus.

Standardisering og reproduserbarhet: Ved å følge standardiserte vaskeprosedyrer sikrer forskerne at forholdene er konsistente på tvers av eksperimenter og mellom ulike laboratorier. Denne konsistensen er avgjørende for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultater.

Vaskeprosedyren kan innebære bruk av en flerkanalspipette eller en automatisert platevasker for å dispensere og aspirere vaskebufferen. Vaskebufferen er vanligvis en bufret saltoppløsning som ligner sammensetningen til den opprinnelige bufferen som ble brukt i analysen, men som ikke inneholder noen reaksjonskomponenter.

Tilstrekkelig vask uten overvask er avgjørende. Overvasking kan føre til tap av essensielle komponenter bundet til den faste fasen og påvirke analysens følsomhet. Derfor er vaskeprotokoller nøye utformet for å oppnå optimal fjerning av uønskede stoffer samtidig som integriteten til de immobiliserte molekylene eller analyttene av interesse bevares.