Western Blot Instruksjoner

Western blot -analyse er en velkjent teknikk for identifisering av spesifikke proteiner isolert fra vev. De forskjellige proteiner blir først separert ved ladning og vekt på SDS- polyakrylamid -gel og overført til en nitrocellulosemembran. Etter overføring, merkede antistoffer bindes spesifikt til det ønskede protein , og er fotografert ved hjelp av røntgenfilm eller visualisert ved protein -spesifikk flekk . Det endelige resultatet viser mørke bånd som indikerer tilstedeværelsen av det identifiserte protein. Denne artikkelen fokuserer på grunnleggende metodikk for gjennomføring av Western blot analyse i et laboratorium kvalifisert for komplekst protein forskning . Du trenger
SDS - polyakrylamid gel ( SDS -PAGE ) med separate proteiner arkivNitroCellulosemembran
Destillert vann
Transfer buffer ( 30 g Tris , 144 g Glysin og 200 ml metanol i en l vann )
Filter papir , Whatman 3 mm
Laboratory svamp
Western blot overføring kammer
Laboratory strømforsyning
Laboratory kjøleskap
Laboratory agitator
Tris saltvannsoppløsning ( TBS ) ( 24,2 g Tris Base , 80 g NaCl i 1 l vann )
Blokkering løsning ( 5 prosent melk med lite fett i TBS )
Primær antistoff løsning
merket antistoff konjugert løsning
alkalisk fosfatase underlaget løsning med nitro blå tetrazolium flekken
Phosphate buffered saltløsning ( PBS )
Gel - imager boks på
Vis flere instruksjoner
Overfør Proteiner til Nitro membran
en

Forbered nitrocellulose membran . Membranen skal dynket i destillert vann i to minutter , deretter plassert inn overføring buffer og lov til å suge i fem minutter .
To

Monter en overføring smørbrød bestående av svamp /filter papir /SDS PAGE /nitrocellulose membran /filterpapir /svamp . Sandwich er innrettet slik at membranen ligger nærmere anoden og gelen nærmere katoden inne i overføringskammeret .
3

til overføringsbuffereni kammeret , slik at sandwich- er under vann. Plasser kammeret inne i laboratoriet kjøleskap . Overføring av proteinet fra gelen til membranen bør utføres ved 4 grader Celsius.
4

sette opp strømforsyningen for å overføre proteinene fra gelen til membranen. Retningen av overføringen vender mot anoden er angitt med blymønje . Større proteiner beveger seg hurtigere som reaksjon på en elektrisk strøm , og vil bevege seg først. Strømforsyningen styrer hastigheten av overføringen. Still inn effekten til 30 V og 40 mA for en overnatting overføring .
5

demontere strømforsyningen etter at overføringen er fullført. Ikke ta kontakt med overføring buffer eller fjerne sandwich mens strømforsyningen er koblet til.
6

Fjern membran fra sandwich og inkuberes i to timer i blokkering løsning . Proteiner i den blokkerende løsning vil absorbere inn i membranen hvor ingen proteiner som er til stede. Det vil hindre eventuelle antistoffer fra binding til membranen der den ønskede protein er ikke til stede .
Binding antistoff
7

Inkuber nitrocellulose membran med primær antistoff løsning ved hjelp av en agitator . Membranen må være fullstendig neddykket i oppløsningen i minst en time. Det er akseptabelt å ruge over natten .
8

Vask membranen grundig for å fjerne ubundet antistoff . Fire separate ti -minutters vaskinger med TBS er vanligvis tilstrekkelig for å fjerne overskudd av antistoff.
9

Inkuber membranen i merket antistoff konjugat -løsning ved hjelp av røreverk. Membranen må bli inkubert i en minst en time. Det merkede antistoff -konjugat er bundet til alkalisk fosfatase . Det er den enzym -antistoff- blanding som vil gjenkjenne og binde seg til det første antistoff .
Påvisning av Protein
10

Skyll membranen i 10 minutter i PBS fire ganger . Dette vil fjerne resten av den merkede antistoff -konjugatet .
11

Inkuber membranen i alkalisk fosfatase -substrat -oppløsning inntil båndmønstrevist. Fargestoffet i substratoppløsning vil bindes til antistoff- antigen - protein i membranen og danner en mørk -farget bånd . Prosessen kan være umiddelbar eller kreve opptil 30 minutter før de bandene er observert .
12

Pakk membranen helt inn i cellofan og legg den direkte på gel - imager for å visualisere resultatene . Gelen - imager er i stand til å fotografere de resultatene som vises på Western blot membran .