Molecular Cloning Protocols

Molekylær kloning protokoller omfatte de prosedyrer som benyttes for å definere, isolere og replikerende DNA- sekvens. Tradisjonelle restriksjons og ligation kloning protokoller initiere DNA fragmentering med begrensede endonukleaser (enzymer som kutter DNA-strengene på restriksjonsseter ) , DNA fragment ligation ( reparasjon av diskontinuiteter i DNA-molekyler ) , transfeksjon ( innføring av nukleinsyre i en celle kropp ) og utvalg ( utvelgelsen av individuelle genomer for replikering ) . Isolasjon

protokoller for isolering av DNA- fragment , det første trinnet i molekylær kloning , ofte innlemme en polymerase chain reaction ( PMR ) , som bruker sykluser av oppvarming og kjøling for å forsterke biter av DNA . For å nå det mål -sekvensen størrelsen andre protokoller inkluderer DNA sonikering , reaksjonsenzymbehandlingog bruk av kjemisk syntetiserte oligonukleotider . Disse protokollene varierer avhengig av størrelsen og mengden av isolert DNA nødvendig .
Ligation arkiv

Protokoller for ligation bære å bruke et enzym , DNA ligase , til å bli DNA- molekyler sammen med en kovalent binding . Protokoll dikterer kombinere DNA-fragmenter , kloningsvektoren , kan en ligeringsbuffer, DNA ligase og sterilisert vann i et mikrosentrifugerør og inkubering over natten ved 4 grader Celsius.
Transfeksjon

Protocols for transfeksjon eller infusjon av DNA inn i en celle ved å bruke en ikke- virale midler, ofte involverer injisering av DNA direkte inn i cellen cytoplasma . Andre fremgangsmåter omfatter bruk av kjemiske reagenser , som for eksempel kalsiumfosfat , og lipider, for å levere den transfeksjon kompleks gjennom cellemembranen . Denne metoden tester effekten av genmodifisering på funksjon av spesifikke gener .
Selection

Selection , eller screening , protokoller bestemme hvilke celler vellykket avholdt DNA innskuddet og indikere som cellene trenger isolering . En sentrifuge høster celler som inneholder transfektert DNA, som deretter blir inkubert i et lysozym ( et naturlig forekommende enzym ) -buffer og behandlet med et alkalisk middel, noe som gir proteiner og membraner oppløselighet. Ved hjelp av acetat for å utfelle proteinene , en sentrifuge og osteklede filtrere DNA - inneholdende supernatant ( det oppløselige væskegjenværende fra en sentrifugert forbindelse ) . Supernatanten ble utfelt med polyetylenglykol , sentrifugert og suspendert i en cesium -klorid og etidiumbromid buffer. Den etidiumbromid flekker DNA i henhold til tetthet, og ved hjelp av en langbølget UV-lys , blir det nedre bånd -DNA ekstrahert med fem cc sprøyte. En ionebytterkolonne ekvilibrert skiller DNA fra etidiumbromid og cesium -klorid , og den endelige DNA- pellet ble suspendert i en buffer løsning og detekteres på agarosegelelektroforese .