Forplantning av rekombinante plasmider

Funnet i enkelte bakterier og gjær arter , plasmider er forholdsvis liten , selvreproduserende ringer av DNA som ligger utenfor en celle hoved kromosom . De er svært nyttige ved genteknologi , fordi det er relativt lett å skjøte utvalgte gener fra andre arter inn i plasmider , overføre dem hos vertsceller fra samme eller forskjellige arter , og stimulerer dem til å replikere - eller utbre - ved mye høyere enn - normal - eller forsterket - priser . Rekombinante plasmider er rett og slett de som har blitt utviklet for å inneholde gener fra andre arter . Spesielt med forsterket forplantning , kan rekombinante plasmider raskere og lett uttrykkelig ønsket proteiner på en stor, industriell skala . Du trenger
preexisting plasmid og genet biblioteker eller plasmider og gener du har isolert deg fra sine vertsorganismerog skjøtes sammen en Cell kultur utstyr
Amplification agenten ( er) for eksempel kalsiumklorid , elektrisk støt , kulde og varme , kloramfenikol , elektrisk støt og /eller Taq polymerase enzym på
Vis flere instruksjoner
en

Velg forsterkning prosedyre eller prosedyrer som best passer ditt spesifikke rekombinant plasmid og vert organisme. Noen prosedyrer fungerer bedre med visse plasmider og verter enn med andre. Hvis du arbeider med en roman , fortsatt - eksperimentell rekombinant plasmid og /eller prøver ut en annen vertsarter , må du kanskje finne det beste amplifikasjonsprosessen eller prosesser gjennom prøving og feiling .
To

Prøv prosessen kalles transformasjon hvis dine spesifikke plasmid og vertscellearter kan svare på det . Chill celler og plasmider til null grader C i en kalsium -klorid ( CaCl ) oppløsning . Raskt heve temperaturen til 37-43 grader C. Dette brå temperaturendringer fører til at cellemembraner å ta opp større mengder av plasmidet .
3

Send høyspent strøm pulser gjennom løsningen av plasmider og celler hvis elektroporering er den ønskede forsterkning metoden. Denne teknikken øker cellemembran permeabilitet til plasmidene .
4

utsette vertscellekulturfor lave nivåer av antibiotika kloramfenikol å generere så mange som hundre plasmider pr celle. Denne metoden undertrykker replikasjon i vertscelleneshoved kromosomer samtidig indusering ukontrollert replikering av plasmidet , inkludert genet skjøtes inn i den.
5

Påfør polymerase kjedereaksjon -eller PCR -metoden for å generere plasmid- kopier ved svært høye størrelsesordener . PCR er basert på DNA- polymeriseringen , den kjemiske reaksjon gjennom hvilke genetiske sekvenser dannes i naturen. PCR er oftest katalysert av et varmestabilt enzym kalt Taq polymerase , hentet fra en bakteriearter som lever i varme kilder .