Hvordan lage Antistoff Fortynninger for IHC

Immunhistokjemi ( IHC ) er en spesialist teknikk som brukes av forskere til å visualisere celler i vev som har blitt plassert på et lysbilde og farget med en passende antistoff som gjenkjenner et protein som er unik for cellen eller vevet under etterforskning . Antistoff fortynninger ( titreringer ) , må utføres ved hjelp av eksperimentelle forhold som er angitt i brukerens egen protokoll , ikke at av antistoff produsenten , siden de to ikke kan være identiske. Dette er hva du trenger arkiv Cells å farge
Antistoff
Fortynningsbuffer ( " fortynner " )
Pipettes og tips
mikrosentrifugerør
Aluminium folie
Lab markører og tube etiketter
Ice
lys beskyttet lysbilde boks på
Vis flere instruksjoner
en

Sjekk og forberede antistoffet. Kontroller at antistoffet er tatt opp i den riktige verts , og reagerer med den nøyaktige versjon av protein ( kalt isoform eller spleise variant) som er blitt testet . Ved hjelp av en pipette , forsiktig ta en 10 mikroliter del av dette og etiketten som "personlig lager".
P Hvis bare svært små mengder antistoff er tilgjengelige, hoppe over dette trinnet .

Holde en personlig lager av antistoff er rutinemessig praksis i alle laboratorier som det hindrer krysskontaminering av den opprinnelige lager . Tilsett dette inn i en lys- beskyttet mikrosentrifugerør eller en vanlig mikro-sentrifugerør , som er innpakket i aluminiumfolie for å beskytte mot lys.

Holde dette rør på is, fortrinnsvis i en Esky med et lufttettlokk, nytt for å minimalisere lys, noe som kan ødelegge antistoffet. Lag et notat av den opprinnelige bestanden er konsentrasjon ( f.eks 100 enheter per milliliter , en milligram per mikroliter og så videre ) på røret , inkludert navnet på antistoff og hva som eventuelt buffer det er fortynnet i ( f.eks serum , saltvann , eller vann etc ) .
to

Forbered fortynning buffer , også kjent som antistoff fortynningsmiddel . Kontroller at dette er forenlig med antistoff og immunhistokjemi prosedyre som brukes , for eksempel , det bør ikke skjule noe fluorescens eller forhindre påfølgende sekundær antistoff merking . Gjør en standard immuno- fortynning (også sperre buffer) ved å blande 1X fosfatbufret saltvann med 1% Triton - X100 , 10% føtalt kalveserum og 0,2 % natriumazid.
3

titrere antistoff. Med en gitt konsentrasjon av antistoff i den personlige lager ( uttrykt i konsentrasjons- enheter, så som mikrogram mikroliter ) , bestemme volumet av antistoff nødvendig for å få 10 mikrogram av antistoffet.

Sett opp en fortynningsrekke ved å pipettere en volum tilsvarer 2 mikrogram av antistoff (f.eks X mikroliter ), i 100 mikroliter fortynningsmiddel og bland godt med pipettering opp og ned . Fra dette start fortynning , ta samme X mikroliter og legge det til en påfølgende 100 mikroliter fortynningsmiddel . Gjenta dette til 8-10 fortynninger (eller en serie ) er gjort opp .

Siste røret vil derfor ha den laveste konsentrasjon og være " mettende " konsentrasjon som vil gi den høyeste grad av signalet i løpet av eksperimentet . Imidlertid vil det ideelle konsentrasjons være litt mer konsentrert enn dette, slik at ikke for mye signal frembringes , noe som kan føre til bakgrunnsfeil .

Merk rørene fullstendig med de nye fortynnede konsentrasjoner.