Hvordan lage en restriksjon Kart

I de tidlige dagene av molekylærbiologi , forskere brukte begrensning kartlegging for å forstå de genene de studerte . I moderne forskningslaboratorier , er begrensning kartlegging i stor grad utdatert fordi sekvensering har blitt mer allment tilgjengelig og mer økonomisk enn tidligere . Men det er tilfeller der et restriksjonskart kan være tilstrekkelig for en forsker å utføre sine undersøkelser . Den generelle metode for restriksjonskartlegging innebærer bruk av fordøyelsesenzymer for å bryte ned fysisk en prøve av DNA. Når du måle produkter av denne fordøyelsen , kan du " montere " bitene og utlede den opprinnelige sekvensen av DNA . Du trenger
Restriction enzymer
Sample DNA
Buffer løsning
Ice og varmt vannbad
Gel elektroforese utstyr
Vis flere instruksjoner arkiv DNA Fordøyelse

en

Legg en begrensning enzym til din DNA-prøve . Bruk EcoR1 , en vanlig brukt enzymet , for eksempel.
To

Legg denne blandingen til en bufferløsning , som i hovedsak er et sted for reaksjonen til å skje .
3

heve temperaturen av reaksjonen som indikert i New England BioLabs manual . Hvert restriksjonsenzym har en spesifikk reaksjonstemperatur ved hvilken fungerer den beste. I tillegg har hvert enzym en spesifikk nukleotidsekvens som den er utformet for å målrette . EcoRI vil skanne og kutte DNA ved nucleotidsekvensen CAATTC . Denne rekkefølgen av nukleotider må eksistere for enzymet til å binde og kutte DNA . Frem til dette punkt, bør alle materialer holdes på is for å forhindre uønsket aktivitet .
4

Etter å tillate reaksjonen å finne sted som angitt i bruksanvisningen , kjøres blandingen i en gelelektroforese maskin for å separere DNA fragmenter basert på størrelse . De minste fragmentene vil flytte lengst over gel .
5

Mål avstanden reist av hver DNA- fragment . Bør gjentas disse fem trinnene med flere forskjellige enzymer separat.
Konstruere Restriction Kart
6

Ved hjelp av data innhentet fra gelen , samle all informasjonen du har funnet ved hjelp av de ulike restriksjonsenzymer .
7

Utled rekkefølgen på restriksjonsseter ved å sammenligne de ulike fragment lengder produsert av hvert enzym . Hvis for eksempel enzymet 1 produserte to fragmenter av lik lengde og enzym 2 produsert tre fragmenter av samme lengde , kan konkludere med at enzymet # 1 kutt halvveis i DNA og enzym 2 kutter av DNA i tredjedeler .

8

Bruke konklusjonene i trinn 2 , montere rekkefølgen av restriksjonsseter for DNA .