Hvordan gjennomføre en FRET Assay

Fluorescence resonans energioverføring ( FRET ) er et bestemmelsesteknikksom brukes til å måle nærvær og mengde av binding mellom to rapportørbundneproteiner. Dette assay er vanlig brukt til å analysere potensielt bindende proteiner i forskjellige celletyper , og for å måle effektiviteten av konjugering -type enzymer. Den instrumentering som trengs i stor grad avhengig av en rekke rapportørmolekylerblir brukt , selv om mange ganger en enkelt 96 -brønners plateleser kan brukes. Du trenger
Protein-of-interest/Reporter molekyl konstruerer for hvert protein som testes
96 - brønns plate blokk
96 - brønns plate leseren
Reaction buffer ( vanligvis Tris - eller Fosfat bufret - saltvann- basert )
Bøyning enzym ( om nødvendig )
Vis flere instruksjoner
Oppsett og Reading
en

generere eller forberede fusjonskonstruerte av hvert protein av interesse , med hvert blir knyttet til en fluorescens - overføring molekyl som grønn fluorescerende protein ( GFP ) , rhodamin eller boron - dipyrromethene ( BODIPY ) .
to

Bestem absorbans og utslippsbølgelengder av hver fluoriserende komponent og av av hele forsøket . (For eksempel, hvis analysen måler GFP -> Rhodamine fluorescens- energioverføring , er inngangsbølgelengdensom absorbans av GFP sin absorbans ( 488 nm) , og deteksjonsemisjonsbølgelengdeer at for rhodamin ( 595 nm) )
.
3

Lag passende reaksjon buffer for forsøket , avhengig av proteiner av interesse biokjemiske egenskaper . En TRIS - basert buffer blir ofte brukt, inkludert kalsium -klorid og 0,05 prosent Tween -20 . Spesifikke konsentrasjoner og komponentene kan bestemmes ved å søke etter bilag som viser lignende reaksjoner og betingelser .
4

Bland de to reporter -konjugerte proteiner av interesse i forskjellige konsentrasjoner i reaksjonsbuffer , og alikvoter 50-200 ul per brønn . Legg til en konjugering enzym (for eksempel sortase ) til hver prøve godt dersom det er hensiktsmessig . Ved å utføre en slutt - punkt -analyse , tillater inkubering ved romtemperatur ( eller i enzymets optimale temperatur ) for en bestemt tidsperiode , og deretter leses den 96 -brønners plateleser . Hvis du utfører en kinetikk analysen , gå direkte til lesing ( se nedenfor ) .
5

Sett prøveskilt i 96 - brønns plate leseren . Lag et nytt eksperiment siden og få tilgang til innstillingsmenyen . Input riktig absorbans ( eksitasjon ) og utslippsbølgelengder, må du velge riktige brønnene som skal leses .
P Hvis du utfører en kinetikk eksperiment , satt tids løpet av eksperimentet og målingene intervall (for eksempel en gang hver 10 minutter ) .

Begynn å lese prøven .

Analysere data ved hjelp av Microsoft Excel graffunksjon( eller en annen grafisk program som GraphPad ) .