Helse og Sykdom
1. Ko-immunutfelling (Co-IP) :Co-IP er en mye brukt teknikk for å studere protein-protein-interaksjoner. Det involverer immunutfelling av ett protein (agnprotein) fra et cellelysat ved bruk av et antistoff spesifikt for agnproteinet. Det immunutfelte proteinkomplekset blir deretter analysert for å identifisere andre proteiner (bytteproteiner) som interagerer med agnproteinet. Co-IP kan følges av forskjellige nedstrøms analysemetoder, for eksempel Western blotting, massespektrometri eller immunfluorescensfarging.
2. Pull-down-analyser :Pull-down-analyser er basert på prinsippet om affinitetskromatografi. Et agnprotein immobiliseres på en fast bærer (som magnetiske perler eller agaroseharpiks) gjennom kovalent binding eller fusjon med en tag (f.eks. GST eller His-tag). Cellelysatet eller renset proteinblanding inkuberes deretter med det immobiliserte agnproteinet. Etter vasking for å fjerne ubundne proteiner, elueres og analyseres de interagerende proteinene (bytteproteinene).
3. Fluorescensresonansenergioverføring (FRET) :FRET er en teknikk som måler overføringen av energi mellom to tettliggende fluoroforer (donor og akseptor). Når donor- og akseptorfluoroforene er i umiddelbar nærhet (typisk innenfor 10-100 Å), resulterer eksitasjonen av donorfluoroforen i emisjon av lys fra akseptorfluoroforen. Denne energioverføringen kan kvantifiseres og brukes til å overvåke protein-protein-interaksjoner. FRET kan implementeres på forskjellige måter, inkludert merking av proteiner med spesifikke fluoroforer eller ved bruk av genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og RFP).
4. Biomolekylær interaksjonsanalyse (BIA) :BIA, også kjent som overflateplasmonresonans (SPR), er en etikettfri teknikk som måler endringer i brytningsindeksen ved grensesnittet mellom et glassglass og en flytende væske. Ett av de interagerende proteinene er immobilisert på glassoverflaten, og det andre proteinet føres over overflaten. Samspillet mellom proteinene fører til endringer i brytningsindeksen, som kan påvises og kvantifiseres. BIA kan gi informasjon om bindingsaffiniteten og kinetikken til protein-protein-interaksjoner.
5. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) :ITC er en teknikk som måler varmeendringen knyttet til interaksjonen mellom to molekyler. Når proteiner interagerer, frigjøres varme enten (eksotermisk) eller absorberes (endotermisk). ITC kan kvantifisere bindingsaffiniteten (Kd) og termodynamiske parametere, slik som entalpi-endring (ΔH) og entropi-endring (ΔS), av protein-protein-interaksjoner.
6. Protein Interaction Arrays :Proteininteraksjonsmatriser involverer high-throughput-screening av protein-protein-interaksjoner i et mikroarray-format. Tusenvis av forskjellige proteiner eller peptider immobiliseres på en fast overflate, og bindingen av et spesifikt protein av interesse påvises ved bruk av merkede antistoffer eller andre deteksjonsmetoder. Denne teknikken muliggjør rask og storskala analyse av protein-protein-interaksjoner.
7. Gjær to-hybrid (Y2H) analyse :Y2H-analysen er en genetisk metode som brukes til å identifisere protein-protein-interaksjoner i gjærceller. Det innebærer å smelte sammen de kodende sekvensene til to proteiner til to forskjellige domener av en transkripsjonsfaktor. Hvis de to proteinene interagerer, rekonstitueres transkripsjonsfaktoren, noe som fører til ekspresjon av et reportergen. Positive interaksjoner identifiseres basert på veksten av gjærceller på selektive medier eller kolorimetriske analyser.
Valget av metode for å studere protein-protein-interaksjoner avhenger av de spesifikke proteinene av interesse, tilgjengeligheten av reagenser og utstyr, og ønsket informasjonsnivå. Kombinasjoner av disse teknikkene kan også brukes for å oppnå omfattende innsikt i protein-protein-interaksjoner.