Slik feilsøker en Three Fragment Ligation

hemorroider er en metode som brukes i biologisk forskning for å bli med separate DNA-tråder . Prosessen har blitt forenklet ved hjelp av kommersielt tilgjengelige ligation kits . En ligeringsprosedyrenblir vanligvis etterfulgt av transformasjon, en prosess som setter det sammenføyde DNA inn i en bakteriell vektor mottakeren, å klone og forsterke DNA. På grunn av kompleksiteten av metoden, resultatene ofte ikke stemmer overens med det ønskede produkt og krever feilsøking . Dette er mer dominerende i et forsøk på å delta i flere fragmenter , for eksempel i tre ligering . Du trenger
Ligation kit
Ligation protokollen
agarosegel
50 X TBA buffer ( 242 g Tris base, 57,1 ml iseddik , 100 ml 0,5 M EDTA fortynnet til 1 liter med vann )
Ion vann
DNA rensing kit på
Vis flere instruksjoner
Feilsøk Transformation
en

Uler en liste over tiltak som er involvert i ligation og transformasjon . Feilsøking noen vitenskapelig protokoll generelt begynner med det siste trinnet , jobbe bakover .
To

Sammenligne renset DNA produkt fra prøven til kontroll DNA , som følger med i settet . Når DNA ble transformert, og klonet i bakterier , kan det bli isolert , renset og kontrollert ved agarose gel elektroforese. Resultatene for elektroforese vil indikere om transformasjon var vellykket .
3

Bestem bakterievekst i løpet av kloning . De fleste bakterielle vektorer er konstruert slik at bare de som har en DNA-innskuddet - vil vokse i et medium inneholdende ampicillin, eller andre antibiotika . Dårlig vekst kunne fastslå at DNA-prøven ikke ble satt inn i vektor.
4

Bekreft at ligatisert DNA-prøven ble renset , før transformasjon . Buffer salter og ligation enzymer kunne hemme transformasjon av det innsatte DNA . Det er også viktig å forsikre seg om at ligerings enzymet ble inaktivert av varmen , etter gjennomføring av ligeringsprosedyren . Aktiv ligase kan potensielt forstyrre transformasjon .
5

Sjekk datoen på bakteriell lager brukes til transformasjon . Gamle bakterielle celler løs effektivitet over tid. Til slutt de bakterielle celler er i stand til å transformasjonen og kvalitet kloning. Når prosessen med transformasjon har blitt diagnostisert , kan du begynne å analysere ligation prosedyre .
Feilsøking Ligation
6

Bekreft renheten av DNA-prøve , før ligering . Salt forurensninger i DNA-prøven kan føre til dårlig ligation . DNA- prøven bør være renset og fri for salter og enzymer , før den brukes i ligering .
7

Kontroller om endene av DNA-trådene som skal ligeres er butt eller klebrig. Ligeringen blir brukt til å koble separate tråder med butte ender eller klebrige ender , etterfulgt av nedbryting med utpekte restriksjonsenzymer . T4 DNA ligase er enzymet av valget for butte enden DNA - men det vil også arbeide for DNA med klebrige ender . Andre DNA ligaser kan bare fungere for DNA , etter en begrensning fordøye å skape klebrige ender . Det er viktig å bruke riktig ligase for DNA testet .
8

Sjekk konsentrasjonen av DNA-prøver før ligation . Ved hjelp av DNA med høy konsentrasjon fører ofte DNA til å bli lineær . Veiledningene for settet vil gi informasjon om riktig mengde DNA til å bruke i en ligation reaksjon .
9

Bytt ligase enzym med et nytt parti . Enzymer er spesielt følsomme ved romtemperatur og videre fryse-tinesykluser . Den ligase kan skades etter en rekke anvendelser , ganske enkelt ved å fryse og tine for mange ganger. Noen kits anbefaler at ligase alikvoteres i mindre porsjoner ved førstegangs bruk , for å redusere antall ganger det er fryses .
10

Kontroller ligation kit. Ofte problemet med ligation bruker et kit som er utløpt eller blitt forurenset med annet DNA og salter .