Hvordan utføre en ELISA -analysen

En ELISA , eller enzym - bundet immunoabsorbans måling , er en biokjemisk laboratorieteknikkutført for å påvise et antigen (slik som et protein ) eller antistoff i en forsøksprøve. Analysen tar fordel av antistoff -antigen- binding , og kan brukes for å bestemme andre celle og molekylære bindingsmekanismeri tillegg. I en proteinbasert ELISA-analysen , en " fange " antistoff eller protein er nedfelt i en analyse rett og lov til å overholde de fatet , hvoretter "probe " middel ( slik som en protein av interesse ) er nedfelt , og inkubert med det fangende middel . Etter flere vaskinger , en " deteksjon " antistoff blir tilsatt for å visualisere nærværet eller fravær av antistoff - antigen -eller protein - proteinbinding. Du trenger
analysen fatet ( for eksempel 96 -brønn blokk )
Capture antistoff ( fortynnet til 5 ug /ml i 50 mM NaHCO2 , pH 9,6 )
Probe antistoff /protein ( fortynnet til ulike konsentrasjoner) arkiv Detection antistoff (for eksempel pepperrot- peroksydase -koblet antistoff)
PT buffer ( 1 x PBS, 0,05 prosent Tween -20)
Blokkering buffer ( 1 x PBS med 5 mg /ml BSA, eller 5 prosent skummet melk i 1x PBS )
Detection reagens ( dvs. TMB reagens blanding )
Mekanisk lab shaker
Kaldt rom eller kjøleskap
pipetter og tips på
Vis flere Instruksjoner

1

Fortynn fange -antistoff til 5 ug /ml i 50 mM NaHCO2 (pH 9,6) . Tilsett 50 ul til hver brønn av prøven fatet brukt for testing. Dekk med plast eller aluminium og inkuberes over natten ved 4 grader C på en shaker .
To

Dump ut fangst antistoff og vask to ganger med 200 uL PT buffer . Tilsett 200 pl av blokkeringsbufferper brønn (PB eller 5 prosent skummet melk ) . Inkuber alt fra to timer til over natten mens risting ved 4 grader C.
3

Dump ut blokkering buffer og vaske fire ganger med 200 uL PT buffer . Legg til " probe " proteinprøver ved forskjellige konsentrasjoner i PB eller 5 prosent skummet melk , tilsetning av 100 ul per brønn . Inkuber en times rysting ved 4 ° C. dumpe ut probe løsninger og vaskes seks ganger med 200 pl buffer PT .
4

til deteksjon -antistoff (HRP - konjugert antistoff ) fortynnet 1:4000 i PB buffer eller 5 prosent skummet melk (enten en som inneholdt 0,05 prosent Tween -20) , tilsetning av 50 uL per prøve godt . Inkuber i 30 minutter til én time , risting ved 4 ° C.
5

dumpe ut deteksjon -antistoff -oppløsning og vaske seks ganger med 200 uL PT buffer per brønn , etterfulgt av vasking to ganger med 200 pl av 1x PBS ( fosfatbuffret saltoppløsning ) . Dumpe ut PBS og tilsett 100 pl av deteksjons reagens per brønn (for HRP bruke fersk- blandet TMB -reagens ved blanding av TMB substrat -og peroksyd på 1:1). Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur , risting av og til.

Ved bruk av TMB og HRP : Endelig tilsettes 100 pl av 1 M H3PO4 ( fosforsyre ) per brønn for å stanse reaksjonen TBM

Les plate ved hjelp av prøveanalysen leser, for eksempel en 96-brønns plate -leser . . (For HRP og TMB , bruke " ELISA End - Point analysen " mal tilgjengelig på de fleste lesere . )