Konkurrerende Binding Assay Protocol

Den konkurrerende bindingsanalyse er et eksperiment som bestemmer bindingskapasitet av proteiner eller kjemikalier for spesialiserte proteiner som finnes på celleoverflaten, som kalles reseptorer. Metoden er ofte brukt i medisinsk forskning , men er også i stand til å bestemme hvilke stoffer binder seg til reseptorer og modifisere reseptor -aktivitet , som i sin tur kan endre celleadferd . Cell Forberedelse

Re - suspendere celler i iskald fosfat saltvann ( PBS ) . Mål proteinkonsentrasjon for å bekrefte like proteinnivåer ved hjelp av et spesialisert kommersielt tilgjengelig protein -assay.
Assay

til et radiomerketprotein som er kjent for å binde til reseptoren , er ligand , til cellen eller vevet suspensjon. Tilsett konkurrenten , som er den testmedikament eller proteinet som studeres og inkuberes med den radioaktive ligand , og cellesuspensjonen. Et område av konsentrasjoner av testmedikament bør studeres . Etter inkubasjon , separat bundet og ubundet ligand og måle radioaktivitet .
Data Analysis

Den vanlige tiltak som skal bestemmes er halve den maksimale konsentrasjonen som hemmer reseptor ellers kjent som IC50 . Dette er beregnet ved å plotte konsentrasjonen på en logaritmisk skala på X- aksen i en graf , mens Y-aksen står for prosent av inhibering ; en sigmoid kurve, noe som er en S- form, bør bli generert. Den IC50 er 50 prosent hemming punkt , og den tilsvarende konsentrasjonen kan leses fra grafen .