Hvordan måle NADH

NAD og NADH er begge pyridine nukleotider involvert i stoffskiftet . NADH og NAD er co-enzymer som finnes i mitokondriene , kraftstasjoner i cellen. Både NAD og NADH er involvert i cellulære reaksjoner som respirasjon og fotosyntese hvor energi og hydrogen blir generert . NAD og NADH brensel biokjemiske reaksjoner som krever en rekke enzymer for å produsere ATP , den viktigste energikilden i celler. Du trenger arkiv Celler eller vev under studien
NADH analysen kit
Fosfat saltvann
Dry Ice
Oppvarming blokk
96 brønners plate
Sentrifuger
Merket rør
Plate leser
Vortex
kjent konsentrasjon av NADH på
Vis flere instruksjoner arkiv analysen
en

Vask celler eller vev under studien med kaldt fosfat - bufret saltoppløsning , PBS. Ekstraher celler eller bryte opp vevet i utvinning buffer ved å plassere blandingen på tørr is i 20 minutter og deretter ved romtemperatur i 10 minutter. Gjenta .
To

Vortex i 10 sekunder . Spin i en sentrifuge i 5 minutter for å pelletere celler eller vev rusk. Fjern supernatant , væskefasen , og plassere det flytende i et rent rør .
3

Filter supernatanten gjennom et spesialisert filter for å fjerne enzymer som vil sammenbrudd NADH .
4

Fjern 200 mikro- liter, sted i et rent rør og oppvarmning ved 60 grader Celsius i en varmeblokk i 30 minutter for å denaturerer NAD . Heftig og sentrifuger og fjerne væskefase . Overfør 50 mikro liter i en 96 -brønns plate ; hver prøve skal være i duplikat eller triplikat . For å bestemme total NAD , NADt , ikke varme .
5

Utarbeide og legge sykling blanding til 96 -brønns plate . Bland og inkuberes i 5 minutter . Tilsett 10 mikro liter fremkaller og la det inkuberes ved romtemperatur i opp til 4 timer. Legg stopp løsning . Les fargeendring på en plateleser eller fluorimeter avhengig av kit .
Standard Curve og Beregning
6

Forbered en standardkurve ved å ta en kjent konsentrasjon av NADH og fortynne det i utvinning buffer . Spe inn i ulike konsentrasjoner , sikre volumet forblir den samme som testprøver. Plate på den samme 96-brønns plate som testprøver . Les optisk tetthet .
7

Tegn standard kurve grafen med konsentrasjon på X- aksen og optisk tetthet på Y-aksen . Ta et gjennomsnitt på hver prøve og lese konsentrasjonen fra standardkurven grafen .
8

Beregn NAD /NADH ratio ved å trekke total NAD , NADt , fra NADH og deretter dele på NADH .