Pepsin er mest effektivt i et surt miljø, spesielt ved en pH på rundt 1,5 til 2,0. Dette pH-området er typisk for magen på grunn av tilstedeværelsen av saltsyre. Under disse sure forholdene gjennomgår pepsin konformasjonsendringer som aktiverer det katalytiske stedet, slik at det kan spalte peptidbindinger i proteiner effektivt.
Når pH øker utover det optimale området, reduseres aktiviteten til pepsin gradvis. Dette er fordi høyere pH forårsaker endringer i enzymets struktur, noe som fører til redusert binding til underlaget og redusert katalytisk aktivitet. Når pH stiger over 4, blir pepsin stort sett inaktivt.
pH-avhengigheten til pepsin sikrer at det primært er aktivt i det sure miljøet i magen. Når maten kommer inn i magen, utløser de sure forholdene utskillelsen av pepsin, som starter prosessen med proteinfordøyelse. Når maten passerer inn i tynntarmen, øker pH, noe som forårsaker denaturering og inaktivering av pepsin, og andre enzymer tar over fordøyelsesprosessen.
Derfor er effektiviteten til pepsin faktisk påvirket av pH, og aktiviteten er optimal i det sure miljøet i magen.