Cell Surface Biotinvlerina Protocol

Biotinvlerina bruker muligheten av løselige vitamin biotin bindes til celleproteiner . Biotin binder seg til protein strepavidin , og er derfor nyttig i cellebiologi å visualisere celleproteiner . Biotinylering tillater sikker merking av proteiner sammenlignet med teknikker som radioaktivitet og ikke påvirker cellens normale funksjon . Den tillater forskere for å studere celleproteiner slik som reseptorer , og som muliggjør en bedre forståelse av sykdommer og sykdomsprosesser . Merking Suspendert Cells

Vask cellene i iskald fosfat saltvann ( PBS ) til å fjerne forurensninger . Buffere som inneholder tris og glycin vil konkurrere med biotinylering , og bør unngås . For å unngå biotinylating indre proteiner , kan merkingen bli utført ved 4 grader Celsius eller i nærvær av azid . Suspender cellene i PBS og løselig biotin , sulfo - NHS - LC - biotin .
Merking heftende celler arkiv

Vask cellene i PBS og inkuber med et produkt som sulfo -NHS -LC -biotin . Cellene blir deretter skrapt inn i en tallerken og lysert i en buffer som inneholder vaskemiddel Triton - X 100 og forberedt for visualisering .
Forbereder merkede celler

Etter inkubering blir cellene sentrifugert i en pellet og vasket i PBS. Cellene blir resuspendert i PBS og renset med IgG sepharose gel. Den bundet protein fortynnes i laste- buffer og oppvarmet til 100 grader Celsius.
Visualisering Cells

Fortynnede proteiner kan visualiseres ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese ( SDS- PAGE ) etterfulgt av blotting med protein og enzym- blanding , streptavidin - pepperrot- peroksyd . Blotter er visualisert med en kjemisk reaksjon --- chemiluminescence --- som avgir lys . Spesifisitet av biotinylering kan bekreftes med antistoffer for proteinet som studeres .