Slik tester for Nucleic Acids

Testing for nukleinsyrer utføres i medisinsk diagnostikk for å detektere patogener , slik som virus eller bakterier . Disse testene er mye raskere og derfor muliggjøre en lege for å starte behandling for en pasient som vanligvis ville ha måttet vente på bekreftelse av infeksjon ved hjelp av mer langvarige og kjedelige antistoff - baserte analyser . Fremgangsmåten er også kjent som en nukleinsyre forsterkning test , og omfatter en metode som er kjent som " revers - transkriptase forsterkning " ved polymerase- kjedereaksjon. Siden dette er et høyt spesialisert vitenskapelig prosedyre , avansert kunnskap og kompetanse i molekylærbiologiske teknikker og teori er nødvendig . Du trenger
PCR-rør
PCR cycler
Pipettes og filter tips
Hansker
Cells
Trizol eller annet RNA Ekstraksjonsreagens
PCR buffer
Taq polymerase
RT - PCR primere på 1 mg /ml konsentrasjon
RNase -fritt vann arkiv dNTPs arkiv MgCl2 arkiv Tilfeldige primere på 1,8 mg /ml konsentrasjon
Super II revers transkriptase

Vis mer Instruksjoner
prosesser osv av RNA
en

Harvest- celler med en RNA Ekstraksjonsreagens , slik som Trizol . 1 ml , er tilstrekkelig til å samle celler fra én brønn av en seks -brønners vevskultur plate. Cellene ble grundig pipettert opp og ned for å homogenisere dem, og deretter å utføre ekstraksjonen prosedyren som beskrevet i Trizol dataark. Kort, ekstraher med kloroform, deretter sentrifuge for å separere faser av DNA, protein og RNA. Gjenopprette bare den fargeløs RNA fasen og fremskynde at med isopropanol . Etter inkubasjon , sentrifuger det og rydde opp den resulterende pellet med flere etanol vasker . Deretter resuspender pelleten i RNase - fritt vann .
To

For revers transkripsjon , denaturere nøyaktig 5 mikrogram RNA ved 65 grader Celsius i en 10 mikroliter ( ul ) volum av RNase - fritt vann , deretter raskt legg på is . For hver reaksjon , kombinere 10 pl av RNA , 3 ul av 10X PCR- reaksjonsbuffer , 2,5 ul av 10 millimolar dNTP , 6 l av 25 millimolar magnesiumklorid, 1 ul av tilfeldige primere på 1,8 milligram per milliliter konsentrasjon, og 0,5 ul av Superscript II revers transkriptase enzymet . Fyll opp hver reaksjon med 17 ul av RNase - fritt vann . Inkuber rørene ved romtemperatur i ti minutter, og deretter ved 42 ° C i en time for å produsere cDNA , og deretter denatureres ved 95 grader Celsius og raskt is for å stoppe reaksjonen .
3

for en polymerase kjedereaksjon , igjen å sette opp en reaksjonsblanding på 0,5 ml rør ved å kombinere 6 ul cDNA laget i motsatt transkripsjonsreaksjon, 1,5 ul 10X PCR- reaksjonsbuffer , 0,2 mikroliter av Taq-polymerase , 0,5 mikroliter av revers primer og også av forover -primer , og deretter fylle opp hvert rør med 10,3 ul RNase -fritt vann . For å kjøre reaksjoner , sette opp en termosykler (dvs. en maskin som utfører polymerase kjedereaksjoner ) i 30 sykluser som følger: 95 ° C i 0,5 minutt for å denaturere , etterfulgt av 60 ° C i 45 sekunder for å anneal , og til slutt 72 grader Celsius for en minutter å forlenge syntetisert karakterutskriften .