Feil for gelelektroforese

polyakrylamidgel-elektroforese , eller PAGE , er en teknikk som vanligvis anvendes for separasjon av organiske molekyler i en biologisk prøve . Molekyler med mindre størrelse og vekt vandrer raskere på en polyakrylamid- gel når elektrisk strøm tilføres . Klare distinkte bånd er generelt observert etter den ferdige gelen inkuberes i en bestemt flekk . Det er en relativt enkel fremgangsmåte . Imidlertid fravær av bånd eller bånd som sverte eller er urent kunne indikere et problem i ett eller flere trinn ved fremgangsmåten . Du bør følge grunnleggende retningslinjer for å feilsøke en gel elektroforese metode når resultatene ikke blir som forventet . Du trenger arkiv kvalitet klasse bis : akrylamid eller prefabrikkerte plater arkiv To glassplater arkiv Akrylamid : Bis
TBE Buffer ( TRIS , borsyre , EDTA )
Strømforsyning
Øvre buffer kammer og Basse buffer kammer
Protein av DNA-prøve
TEMED
ammoniumpersulfat
Gel flekken på
Vis flere instruksjoner
en

Start med det siste trinnet av gelelektroforese først og arbeide bakover. For gelelektroforese , er det siste trinnet fargingsfremgangsmåtenbrukt til å observere prøvebånd . Noen få problemer faktisk skulle skje i løpet av fargeprosedyre . Imidlertid bør pulverisert flekker være godt oppløst i den passende buffer før de blir brukt til å sette flekker på en gel. Finne den riktige konsentrasjonen av flekken ble brukt .
To

Sjekk strømforsyningen. Fraværet av band kunne indikere strøm eller spenning var for høy og stikkprøvene migrert av gel . Høye innstillinger kan også føre til prøvekomponenter til å migrere gjennom gel for fort , forårsaker dårlig oppløsning og band som vises urent . Prøver som ikke kan migrere gjennom den gel hvis strøminnstillinger lav. Prøver kan også drive fra brønnen der de ble lastet og ikke vandrer gjennom gelen .
3

Sjekk væsken akrylamid brukes til å kaste polyakrylamidgelen . Vanligvis andelen av akrylamid brukes til å kaste en polyakrylamidgelen varierer fra 5 til 15 prosent . Prøver som består av større molekyler er lastet på en 5 prosent gel fordi store fragmentene beveger seg langsommere på geler med en høyere prosentandel av akrylamid . Små molekyler som er lastet inn i en høyere prosent gel , fordi en lav gel -konsentrasjon ikke ville være i stand til å løse mindre prøver .
4

Kontroller de reagenser som brukes for å polymerisere akrylamid . Et polyakrylamid gel er dannet ved polymerisering av en flytende blanding som består av bis-akrylamid og akrylamid . Ammoniumpersulfat og TEMED legges til akrylamid å katalysere gel formasjon. Vanligvis bør den akrylamid vise tegn på polymerisering ( geldannelse ) i 15 minutter etter at ammoniumpersulfat og TEMED er blitt tilsatt. Polymerisasjonen som oppstår for raskt er et resultat av høye mengder av ammonium -persulfat . For lite ammoniumpersulfat kan føre til ufullstendig eller ujevn polymerisasjon .
5

Bekreft mengden av prøvene lastet . Høye konsentrasjoner av prøver kan bevege seg tregt inn i gelen og redusere bånd -oppløsning. Et prøvekonsentrasjonsom er lav , kan ikke observeres etter at gelen er blitt farget. Disse flekkene har begrensninger med hensyn til det minimum av prøven som kan avbildes som et resultat av flekken følsomhet .
6

Bekreft kvaliteten på prøvene lastet . Salter og andre forurensninger som er tilstede i en prøve kan påvirke bevegelsen av prøven langs gel. Elektroforese er et resultat av elektrisk strøm som går gjennom en gel som inneholder en strøm -ledende buffer; høye saltkonsentrasjoner i prøven kan påvirke bevegelsen av denne strøm gjennom gelen. En isolering av en prøve skal inkorporere et rensesettsom vil produsere en relativt ren prøve .
7

gjennomgang litteratur eller skrevet protokoll for å bestemme om den riktige PAGE ble brukt til å utføre forsøket. Andelen av akrylamid i PAGE er bestemt av størrelsen av prøven som skal testes. Litteraturen kan også gi spesifikk informasjon med hensyn til å sette opp strømforsyningen og sats på et prøveoverførings .