Helse og Sykdom
nedfrysing prosedyrer er de som tillater cellene å lagres på ubestemt tid ved hjelp av ekstremt kalde temperaturer for å suspendere metabolske aktiviteter . Det finnes to hovedtyper av nedfrysing prosedyrer : likevekts ( konvensjonell langsom frysing ) og ikke- likevekt eller ultra - rask frysing ( vitrification ) . Begrepet vitrification kommer fra det latinske " glasslegemet " eller glassaktig . Begge prosedyrene bruker cryoprotectants med frostvæske - type eiendommer for å hindre celleskader under fryseprosessen . Når cellene er frosset eller forglasset , kan de lagres i det uendelige ved å dyppe dem i flytende nitrogen, et ekstremt kaldt fluid med en temperatur på -196 C ( -321 C ) . For å gjenopprette metabolsk aktivitet i cellen etter tining må toksiske cryoprotectants bli fjernet fra cellen og den normale vannbalanse gjenopprettes etter hvert som cellen returneres til en normal funksjon temperatur.
Cell- Spesifikke faktorer
Fremgangsmåten som brukes til å cryopreservere celler eller vev er avhengig av en rekke faktorer, inkludert størrelsen på cellen , mengde cellulære fluid ( cytoplasma ) og kompleksiteten av cellen ( enkeltcelle eller vev) . Celler med en stor mengde av cytoplasma som egg er vanskeligere å cryopreservere enn celler med kun rest cytoplasma , som sædceller . Kryokonservering ovarial vev er mer utfordrende fordi minst tre forskjellige celletyper av varierende størrelse er til stede i eggstokk vev, hver med forskjellige optimale fryse behov. Langsom frysing - protokoller er blitt brukt med suksess med forskjellige typer av celler. Forglassing er for tiden mest effektivt med encellede frysing og mindre effektive med vev , men forskning pågår for å optimalisere Vitrifisering av vev .
Rolle Cryobeskyttelsesmidler
cytoplasma en celle inneholder vann , som blir til iskrystaller på frysepunktet . Når det dannes is inne i en celle , blir cellen strimlet og dør . Derfor må fluidet i cellen som skal fjernes før det når frysetemperaturer for å unngå celleskader. Forskjellige typer av frostvæske ( kryobeskyttende ) fluider kan brukes til å dehydratisere cellen før frysing , inkludert glycerol , propandiol , dimetyl sulfoxde (DMSO) , etanol og sukker som sukrose og trehalose . Den optimale hastighet på kjøle ( og tining ) avhenger av typen av kryobeskyttende brukt og på karakteristisk for cellen eller vevet for å være (eller som var) fryses . Cryoprotectants er giftig for metabolizing cellene slik celle eksponeringer til cryoprotectants på varmere metabolske temperaturer må minimeres eller unngås . Ved tining eller oppvarming cellene , må cryoprotectants fjernes helt fra cellen før metabolsk aktivitet er gjenopprettet .
Equilibrium Versus Non - Equilibrium Kryopreservering Prosedyre
Satsen for frost avhenger av om fryseprotokoller likevekts - eller ikke- equilbrium basert. For likevekt typen prosedyrer, er den optimale frysehastighetoppnås når det er balanse mellom frekvensen som cellen blir dehydrert med vann og den hastigheten som vannet utenfor cellen blir transformert til is- stadiet . Disse likevekts eller sakte -fryse- protokoller vanligvis ta flere timer å fullføre, og en datamaskin brukes til å kjøre en programmerbar sats fryser for å sikre at frysing priser er nøyaktig slik de skal . Det er vanligvis en " hold" trinn i protokollen nær start å tillate manuell oppretting av start iskrystaller eller " seeding " i fluidet utenfor cellene .
forglassing , er en helt annen tilnærming til frysing som ikke er avhengig av ramper og å oppnå en likevekt mellom dehydrering og is- krystalldannelse benyttes. Forglassing er så ultra- hurtig at det ikke er tilstrekkelig tid for dannelse av is og det cellulære fluid blir omdannet direkte inn i en glasslegemet eller glassfase, uten skade på cellen. Programmerbare rente frysere er ikke nødvendig fordi cellen er direkte kastet ut i ekstremt kaldt flytende nitrogen , oppnå en øyeblikkelig glassaktig tilstand .
Slow - Freeze Prosedyre
første trinn av treg - fryseprosedyreer å eksponere cellen for å kryobeskyttende i en gradvis trinnvis måte til langsomt å tillate ekvilibrering av cellen med det kryobeskyttende mens slippe vann. Når cellene er blitt renset for størstedelen av celle vann, ble cellene i det kryobeskyttende fluid plassert i en beholder med en form , slik som et plastrør , en glassampulle eller en plast vial.The væskevolum som omgir cellene for langsom frysing er vanligvis mindre enn en teskje , og kan bare være noen få dråper . Den pre- merket beholder er fylt , forseglet og satt i en programmerbar fryser, som langsomt senker temperaturen i beholderen over en periode på minutter eller timer til meget lav temperatur. Etter noen minutter med kjøling, må start iskrystaller dannes i beholderen ved " seeding " beholderen. Såing utføres ved hjelp av et verktøy (for eksempel tang) som er blitt pre- kjølt i flytende nitrogen for å berøre beholderen og føre iskrystalldannelse . Dette starter krystall vil initiere kontrollert iskrystalldannelse på ett sted , trygt borte fra cellene . Etter såing er fullført, kan resten av kjøle ramper fortsette. Når beholderen har nådd en temperatur mellom -30 og -85 C , kan den beholder som inneholder cellene bli kastet direkte inn i flytende nitrogen for å fullføre avkjøling til -196 C.
forglassing
Ultra - rask ikke-likevekt chilling prosedyrer som for eksempel vitrification bruke høyere konsentrasjoner av cryoprotectants kombinert med en nesten umiddelbar frysing hastighet oppnås ved stuper celler direkte i flytende nitrogen . Forglassing omgår is- krystalldannelse fase og beveger vannet direkte inn i en glass -aktig fase. Forglassing oppnår det samme endepunkt som langsom frysing, men med en hastighet på -3000C/min , sammenlignet med 10C/min eller mer. For forglassing , blir cellene vanligvis er plassert på tuppen av en halm og overskudd av kryobeskyttende middel er fjernet, slik at bare nok slik at cellen klynger seg til beholderen ved overflatespenning , før stuper i flytende nitrogen. Ettersom fryse er så hurtig , er varigheten av eksponering for cryoprotectants mye mindre og mye høyere konsentrasjoner av cryoprotectants kan tolereres av cellen. Oppvarming av cellen for å returnere den til normal metabolsk funksjon må også være utrolig rask . Håndtering av glassert prøvene er mye mer krevende enn slow- frosne prøvene fordi selv en kort eksponering til en temperatur over at av flytende nitrogen kan starte en uplanlagt oppvarmingen og gjenfrysing , noe som er skadelig for cellen .