Hvordan velge begrensningsenzymer

Begrensningsenzymer er enzymer som kutter både enkelt- og dobbeltstrenget DNA. Hvert restriktionsenzym har en spesifikk nukleotidsekvens, kalt restriksjonsside, som den gjenkjenner og kutter. Begrensningsenzymer brukes til DNA-sekvensering, mutasjonsanalyse og kloning og amplifisering av DNA. Forskere bruker restriksjonsenzymer til å sette genene av interesse i ekspresjonsvektorer, DNA-molekyler som kan replikere separat fra kromosomalt DNA. Vektoren som inneholder genet av interesse, kan deretter innføres i en bakteriestamme for ekspresjon og karakterisering av proteiner.

Identifiser restriksjonsenzymsteder på vektoren din ved å se på et restriksjonskart. Restriksjonskartet vil fortelle hvilke enzymer som vil kutte vektoren din, og hvor.

Velg et restriksjonssymfom som også har et sted som er tilstede på geninnsatsen din, ved å se på sekvensen av sett inn. Sørg for at begrensningsstedet er i en posisjon på innsatsen din som er utenfor genet av interesse, slik at du ikke mister noen del av genet.

Kontroller at det ikke er duplikater av restriksjonssted hvor som helst i geninnsatsen eller vektoren din. Dette vil føre til flere kutt i DNA og gi deg villedende data.

Prøv å velge restriksjonsenzymer som kuttes med klissete ender, i stedet for stumme ender. Sticky ender oppstår når enzymet kutter dobbeltstrenget DNA på en forskjøvet måte, etterlater en enkeltstrenget overheng som letter tilkobling med en innsats kutt på motsatt måte. Blunt ender oppstår når dobbeltstrenget DNA er kuttet på en jevn måte, og disse er vanskeligere å feste.

Velg et annet restriksjonsenzym for begge sider av innsatsen din for å sikre det er satt inn i vektoren i riktig retning og for å sikre at vektoren ikke festes til seg selv.

Prøv å velge to restriksjonsenzymer som fungerer godt i samme buffersystem og temperatur . Hvis dette ikke er mulig, kjør hver fordøyelse separat.

Tips

Noen webprogrammer er utviklet for å identifisere restriksjonsseter på en DNA-sekvens raskt. Et slikt program er fra New England BioLabs.

Ting som trengs

Sekvens av geninnsats

Begrensningskart for valgfri vektor

Liste over restriktjonsenzymer og deres kuttsteder

, , ] ]