QuikChange Mutagenese Protokoller

QuikChange mutagenese er merkenavnet på et kit som brukes i bioteknologisk forskning for å indusere genetisk mutasjon eller DNA endring . Agilent Technologies er selskapet bak produktet , som er tilgjengelig i to versjoner , QuikChange II og QuikChange Lightning . Begge settene inneholder en bufferoppløsning , enzymet DNA polymerase -, farge- reagenser , DNA-sekvenser eller primere , og celleprøver . Mutant Strand Synthesis Reaction Protocol

Teknikere syntetisere to oligonukleotider eller korte DNA-sekvenser som inneholder den ønskede mutasjonen . Da de forbereder styre reaksjon med DNA-sekvenser , dNTP mix -løsning og DNA- polymerase- enzym, destillert vann. Senere , de forbereder en serie av prøvereaksjonerved bruk av forskjellige konsentrasjoner av dobbelt-trådet DNA ( dsDNA ) , samtidig som primer eller oligonukleotider konsentrasjonen konstant , i henhold til produsentens instruksjoner. De holde prøvene ved 203 grader C i 30 sekunder. Prøven inneholdende DNA-segment nummer to blir også testet under temperatursvingninger , en teknikk hvor temperaturendringer i løpet av korte perioder av tid. Endelig er de prøvene plasseres på is i to minutter .
DPN jeg Fordøyelse av amplifikasjonsproduktene Protocol

DPN Jeg begrensning enzymet kutter DNA på bestemte steder . En mikro- liter av dette enzymet blir tilsatt direkte til hver forsterkningsreaksjonunder sin standard mineralolje legget ved hjelp av en mikro- pipette eller spesialisert aerosol -resistente pipettespissen . Imidlertid er en mineralolje overlegg bare nødvendig hvis termosykleren , en anordning som brukes til å forsterke DNA-segmenter , ikke har en hot- top sammenstillingen. Reaksjonen utføres forsiktig blandet og senere satt i en mikro- sentrifuge i ett minutt. Etter det , blir prøvene inkuberes ved 98,6 grader C i en time .
Transformasjon av XL1 -Blue Supercompetent Cells Protocol

XL1 -Blue er et tetracyklin - resistente cellelinje som kommer med de QuikChange mutagenesis kits . I løpet av denne protokollen , teknikere tine cellene , som tidligere ble holdt ved -112 grader C, på is . Deretter legger en mikro- liter av DPN I- behandlet DNA, varme den til 107,6 ° C i 45 sekunder og plasserer reaksjonen på is i to minutter. Etter denne fremgangsmåten, teknikere til en fremstillingen av NZY ( casein hydrolysat og gjærekstrakt) forvarmet til 107,6 ° C og inkuberes i en time. Stoffblandingen blir deretter satt på agar gel plater og inkuberes ved 98,6 grader C i 16 timer .